Susam Bitkisinin Transformasyonu

Özet

Susam (Sesamum indicum L. cv.) Özberk Agrobacterium’a duyarlılığının belirlenmesi amacıyla çeşitli Agrobacterium tumefaciens suşları ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyonu takiben, yabanıl tip A. tumefaciens suşları A281 ve A136 NC tümör indüklerken, reporter gen taşıyan disarmed A. tumefaciens suşu LBA4404/pBI121, transgenik hücreler oluşturmuştur. Yaralı bölgelerde succinamopin suşu A281 tarafından indüklenen tümörler, octopin susu A136 NC tarafından indüklenen tümörlerden daha büyük olmuştur.

Anahtar Sözcükler: Sesamum indicum, Agrobacterium tumefaciens, virülentlik, transformasyon.

Giriş

Susam tohumu, yüksek oranda linoleik ve oleik yağ asidi içerdiğinden ötürü esasen yağlı bir tohum ürünü olarak yetiştirilir ancak Türkiye’de daha çok gıda maddesi olarak kullanılır. Bunun yanında, Türkiye’de susam üretimini sınırlayan bitki hastalıkları, belirsiz çiçeklenme ve ayrıştırıcı kapsüller gibi çeşitli sorunlar vardır. Alternaria sesemicola Kaw., Oxysporum Schlectend .: Fr. ve Phytophora parasitica Dastur gibi bitki hastalıkları önemli hasara neden olmakla birlikte verimi de ayrıca azaltır. Belirsiz çiçeklenme ve ayrıştırma kapsülleri susam üretimini sınırlayan en önemli faktörlerdir. Geleneksel bitki ıslah yöntemleri bazı iyileştirmeler sağlamıştır, ancak yeterli değildir. Bu nedenle, yeni çeşitler geliştirmek için biyoteknoloji gibi yeni teknolojiler kullanılmalıdır.

Agrobacterium tumefaciens yoluyla gen transferi, bu gibi problemlerin üstesinden gelmek için kullanışlı tekniklerden biridir. A. tumefaciens’in vahşi tipte onkogenik suşları, tümörijenite (tümör oluşturmaya sebep olan) için önemli birkaç farklı gen içeren, Ti plasmit adı verilen geniş plazmitlere ev sahipliği yapar. A. tumefaciens suşlarının, Ti T-DNA ile birlikte bireyin (individiual) ilgili gen bölgesinin (genes of interest) bitki genomunun içine aktarıldığı bilinmektedir. Konak aralığına göre yapılan çalışmalara göre Agrobacterium geniş bir dikota ve bazı monokotlara enjekte edilebilir.

Son zamanlarda in vitro rejenerasyon , in vitro yayılım , sürgün ucu kültürü , protoplast kültürü ve susamın naftokuinon (bir kimyasal bileşen) üretimi bildirilmiştir. Bununla birlikte, S. indicum’un Agrobacteria tarafından enfeksiyona karşı duyarlı olduğu bildirilmemiştir. Bu çalışmada amacımız, çeşitli vahşi tip onkogenik A. tumefaciens suşlarının S. indicum’a karşı virülansını ve bir raportör gen taşıyan silahsız A. tumefaciens suşlarını kullanarak susamın gen transferini belirlemektir.

Sonuç

Yabani tip A. Tumefaciens Suşları ile Aşılamalar

Susam bitkilerinin yabani tip Ti-plazmidleri içeren suşlara tepkisi Tablo l’de verilmiştir. Aşılama sonrasında tümör oluşumu 2 hafta içinde ayırt edilebilirdi.

Yabani türler arasında, sadece iki suş (A281 ve A136 NC) susam bitkilerinde tümörleri indüklemiştir. Süksinamopin suşu A281, 3 bitki üzerinde aşılanmış bölgelerde% 54 frekansında tümörleri indüklemiştir (Şekil 1a).

Octopin suşu A136 NC, 3 bitkide aşılama yerlerinde% 50 frekansında tümörleri indüklemiştir. Ayrıca süksinamopin tümörleri, oktopin tümörlerinden daha büyüktü (sırasıyla ortalama 0.2 mm ve 0.1 mm). Bununla birlikte, diğer vahşi tip suşları (ACH5, T37, A6, C58), deney koşulları altında susam üzerinde enfekte olmuştur (Tablo 1).

Kanamisin Direncinin Tayini

Susam tohumları, farklı konsantrasyonlarda kanamisin içeren ve kanamisin içermeyen (kontrol) MS medyada çimlenmiştir. 10 gün sonra, kontrol bitkilerinde (kanamisin olmadan), bütün tohumlar filizlendi ve sağlıklı görünüyordu. Bununla birlikte, kanamisin içeren diğer MS ortamlarında, çimlenme sıklığı% 94 (50 mg/l kanamisin),% 88 (100 mg/l kanamisin) ve% 80 (150 mg/l kanamisin) olarak bulundu. Değişken miktarlarda kanamisin ile desteklenmiş MS ortamında 3 haftalık kültürden sonra, fidan ağartılmış ve kanamisin seviyesinden bağımsız olarak ölmüştür. Bu nedenle, 50 mg / l kanamisin, seçim için uygun görünmektedir.

Kotiledon Explant’ın A. tumefaciens Suşları ile Yetiştiriciliği

Vahşi tip A. tumefaciens suşlarına maruz bırakıldıktan ve 400 mg/1 augmentin içeren hormon içermeyen MS medyasına ekildikten sonra, bazı kotiledonlar tümör oluşumu gösterdi. Ancak sadece iki suş (A281 ve A136 NC) tümörleri indüklemiştir (Şekil 1b). Bu tümörler, bütün eksplantları iki haftalık kültürde kapladı.

Zararsız hale getirilen Agrobacterium suşları (LBA 4404/pBI121 ve pGV 2260/p35S GUSINT) ile birlikte ekimden sonra kotiledon eksplantları, kanamisin (50 mg/l) ve augmentin (400 mg/l) ile takviye edilmiş rejenerasyon medyası üzerinde kallus üretti. Bununla birlikte, sıvı MS medyası (kontrol) ile muamele edilen eksplantlar için, aynı rejenerasyon ortamı üzerinde kallus oluşumu gerçekleşmedi. Böylece, GUS aktivitesini belirlemek için bu calli (kallus) ile histokimyasal GUS tahlili yapıldı. Bununla birlikte, sadece LBA 4404/pBI 121 suşu ile birlikte ekilmiş eksplantlar, GUS gen ekspresyonunu (Şekil 1c) ortaya koydu ve her kotiledon eksplantında 4-5 mavi nokta verdi. Ancak, bu çalışmada transgenik sürgünler elde edilmemiştir. Ön deneylerde, transformasyon verimliliğini arttırmak için gece boyunca bakteri kültürlerinin (1:10, 1:25, 1:50 ve 1: 100) farklı dilüsyonları test edilmiştir. Bununla birlikte, genellikle kotiledon eksplantlarında nekroz miktarı en yüksek bakteri konsantrasyonlarında görülmüştür.

Tartışma

Bu çalışma, susam çeşidinin A. tumefaciens’e duyarlılığı ile ilgili ilk raporu sunmaktadır. S. indicum’un A. rhizogenes ATCC 15834 ile doğrudan inokülasyonu ile indüklenen kıllı bir kök kültürü ile naftakinon üretimi hakkında bir rapor olmasına rağmen, susamın A. tumefaciens enfeksiyonuna duyarlılığı hakkında herhangi bir rapor yoktur.

Bu çalışmada, A281, susam bitkilerinde A136 NC’den daha büyük tümör oluşumu ile sonuçlanmıştır. A281 suşu, geniş aralıklı bir süpervirulant denetleyici suş olarak bilinir ve yeniden kalsitrant türlerini dönüştürmek için çok faydalı olmuştur. Davis ve arkadaşları, A281 suşu tarafından uyarılan tümörlerin, kotiledon domates eksplantlarındaki diğer vahşi tip suşlardan daha büyük olduğunu bildirmiştir. Bu raporlar bu çalışmanın sonuçlarını desteklemektedir.

Son zamanlarda susamın, in vitro rejenerasyon , in vitro yayılma, sürgün ucu kültürü ve protoplast kültürü bildirilmiştir. Taşkın ve Turgut, A. tumefaciens aracılı gen transfer sistemleri için önemli olan sürgün rejenerasyonunu tesadüfi elde etti. Bu sebeple bu rejenerasyon sistemi dönüşüm çalışmaları için kullanılmıştır. Bununla birlikte, kotiledon eksplantlarının zararsız hale getirilen Agrobacterium suşları ile birlikte ekimi, dönüştürülmemiş kontrollere kıyasla rejenerasyon verimini düşürmüştür. Bu azalmanın nedeni daha fazla araştırılmamıştır, ancak susam eksplantlarının A. tumefaciens enfeksiyonlarına aşırı duyarlı yanıtı ile ilgili olabilir. Bu sonuç Orlikowska ve diğerlerinin sonuçları ile tutarlıdır. A. tumefaciens’i aspir fidesi eksplantlarının transforme aracılı transformasyonuna aracılık eden transformasyona etki eden faktörlerin karakterizasyonunu tarif etmiştir.

Ayrıca bakteriyel enfeksiyona aşırı duyarlı yanıtın organojenetik potansiyeli daha da azaltabildiğini, antibiyotiklerin (kanamisin) rejenerasyon üzerindeki olumsuz etkilerinin gözlemlendiğini bildirmişlerdir.

Bu nedenle, farklı antibiyotik seleksiyon sistemlerini denemek faydalı olabilir.
Bu çalışmanın sonuçları susamın vahşi tip Agrobacterium suşları A281 ve A136 NC’ye duyarlı olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kotiledon eksplantlarını, silahsız suşa LBA 4404/pBI121 suşu ile aşılamak suretiyle stabil TDNA transferi elde etmek mümkündür, ancak bu düşük bir frekansta gerçekleşir.

Ancak, susamın düşük rejenerasyon kabiliyetinden dolayı bu çalışmada sürgün olmayan rejenerasyon elde edilmiştir. Alternatif olarak, diğer genotiplerden daha iyi rejenerasyon sistemleri elde etmek mümkün olabilir. Sonuç olarak, transgenik susam bitkilerini elde etmek için vahşi tip onkojenik A281 veya LBA4404/pBI 121’e dayanan zararsız hale getirilen Agrobacterium suşları kullanılabilir.

Dipnot: Dikkat! Bu yayın Türkçe Bilim Kaynak Havuzunun gelişmesi adına Molekülcesi yazarları tarafından “Tubitak Academic Journals” sitesinden Türkçe’ye çvrilmiştir. Bilgilerinize sunarız.

Yazarlar:

• Kemal Melih TASKIN* 
• A. Gülhan ERCAN**
• Kenan TURGUT***

Kaynaklar:

1.  Watson, B., T. C., Currier, M. P., Gordon, M. D., Chilton, Nester, E. W., Plasmids required for virulence of A. tumefaciens, J. Bacteriol., 123, 255-264 (1975).
2. Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leemans, J., van Mantagu, Schell, J., Ti plasmid vector for the introducing of DNA into plant cells whithout alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J., 2, 2143-2150 (1983).
3. Decleene, M., Deley, J., The host range of crown gall, Bot. Rev., 42, 389-466 (1976).
4.  Taskın, K. M., Turgut, K., In vitro regeneration of Sesame (S. indicum L), Tr. J. Bot., 21, 15-18 (1997).
5. George, L., Bapat, V., Rao, P., In vitro multiplication of sesame (S. indicum L) through tissue culture, Ann. Bot. 60 (1) 17-21 (1987).
6. George, L., Bapat, V., Rao, P. S., Plant regeneration in vitro in different cultivars of sesame (S. indicum L), Proceedings of the Indian Academy of Sciences, Plant Sci., 99 (2), 135-137 (1989).
7. Bapat, V., George, L., Rao, P. S., Isolation, culture and callus formation of sesame (S. indicum L cv PT) protoplast, Indian J. Exp. Bio., 27 (2), 182-184 (1989).
8. Ogasawara, T., Chiba, Tada, K., Production of high yield of a naphtaquinone by a hairy root culture of S. indicum, Phytochem, 33, 1095-1098 (1993)
9.  Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykas, PJJ., Schilperoort, R. A., A binary plant vector strategy based on separation of vir and Tregion of the A. tumefaciens Ti plasmid, Nature. 303, 179-180 (1983).
10. Bevan, M., Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucleic Acid Res., 12, 8711-8721 (1984).
11. Deblaere, R., Bytebier, B., De Greve, H., Deboek, F., Schell, J., Van Mantagu, M. and Leemans, J., Efficient octopine Ti-plasmid vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer, Nucl. Acid. Res., 17, 8385 (1985).
12. Vancameyt, G., Schmidt, R., O’Conner-Sanches, A., Willmitzer. L., Rocha-Sosa M., Construction of an intron-containning marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation, Mol. Gen. Genet., 220, 245-250 (1990).
13. Hood, E. E., Fraley, R.T., Chilton, M. D., Virulence of A. tumefaciens strain A281 on Legumes, Plant Physiol., 83, 529- 534 (1987).
14. Charest, P.J., Iyer, V.N., Brain, L.M., Virulence of A. Tumefaciens strains with Brassica napus and B. Juncea, Plant Cell Rep., 8, 303-306 (1989).
15. Murashige, T., Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues culture, Physiol. Plant, 15, 473- 497 (1962).
16. Draper, J., Scott, R., Armitage, P., Walden, R., Plant genetic transformation and gene expression, A Laboratory Manual, Blackwell Scientific. Publications, London (1988).
17. Hood, E. E., Helmer, G. L., Fraley, R. T., Chilton, M. D., The hypervirulence of A. tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T DNA, J. Bacteriol., 168 (3), 1291-1301 (1986).
18. Davis, E. M., Lineberger, D. R., Miller, A. R., Effects of tomato cultivars leaf age, and bacterial strain on transformation by Agrobacretium tumefaciens, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 24, 115- 121 (1991).
19. Orlikowska, T. K., Cranston, H. J., Dyer, W. E., Factors influencing A. tumefaciens-mediated transformation and regeneration of safflower cultivars centennial, Plant, Cell Tiss. Org. Cult., 40, 85- 91 (1995).

Çeviri: Abdülmecit Karakaş

Editör: Elif Berfin KORGAN