Alper Demirezen
Giriş
CRISPR/Cas9 sistemi nükleer genomun düzenlenmesinde yaygın bir uygulama olmasına rağmen, mitokondriyal genomu düzenlemek için kullanmak sorunlu olmuştur. Ana engeller, küçük mtDNA’da uygun düzenleme alanlarının eksikliği ve kılavuz RNA (gRNA)’yı nükleotidlere erişilebilen mitokondriyal matrise aktarmanın geleneksel zorluğu olmuştur.
Yakın zamanda yayımlanan iki makale de, her iki kısımda da gelişmelerin olduğunu öne sürüyor. SCIENCE CHINA Yaşam Bilimleri dergisinde yayımlanan ilk makale de, CRISPR teknikleri mtDNA’da mikro-homolog bölgelerinde ekleme/silme (InDel) olaylarını indüklemek için kullanıldı. Bu InDel olayları, özellikle çift sarmallı kırılma (DSB) lezyonları tarafından harekete geçer. Makalenin yazarları InDel mutagenezisin sgRNA çoğullaması ve iniparib olarak isimlendirilen bir DSB (çift sarmallı kırılmaz/bozunma) onarım inhibitörü önemli seviyede iyileştirildiğini bulmuşlardır akabinde mtDNA’yı manipüle etmek için yeniden kablolama DSB onarım mekanizmalarını önermektedirler. Trends in Molecular Medicine dergisinde yayınlanan ikinci makalede, araştırmacılar farklı nükleer ve mitokondriyal genom düzenleme formlarındaki son gelişmeler ile ilgili küresel bir bakış açısı ortaya koyuyorlar.
Bu yeni gelişmelerden bazılarının iç yüzünü kavrayabilmek adına, biraz genom düzenleme tabanlı bir teknoloji olan çinko parmak nükleazlar (ZFN’ler) teknolojisini mükemmelleştiren ispat edilmiş bir sicile sahip olan mitokondriyal genom düzenleme uzmanı Payam Gammage’a ulaştım. Bu nükleazlar mitokondriyal çift sarmalında (mtDNA’da) yer alan baz çiftlerini hedefleyerek kusursuz bir şekilde ayırabilmektedir ve böylelikle de heteroplazmik mitokondriye ait hatalı nükleotitleri de ortadan kaldırabilmektedir. Daha yakın bir zamanda Payam, kanserdeki en çok mutasyona uğrayan 30 genin 25’inin mtDNA’da bulunduğunu keşfetmiştir. Bu mutasyonlar bütün tümörlerin %60’ının spesfik lokuslarında meydana gelmektedir ve en azından kolorektal kanserli hastaların aslında wtDNA ile kıyaslandığı zaman yaşam süreleri yaklaşık olarak 9 yıl uzattığı bilinmektedir. Kolorektal kanserlerin %70’inde, en az %5’ten daha yüksek heteroplazma seviyesinde bir adet mtDNA bulunmaktadır.
Nükleazlar doğru mitokondriyi seçerek zararlı mutasyonları düzenleyebilen, yeni varyantları düzenleyebilen bir teknoloji olup tabiri caizse henüz mükelleştirilmemiş bir tekniktir. Yukarıda bahsi geçen yazıda CRISPR düzenleme yöntemleri her ne kadar umut verici gibi görünse de, Payam rüzgarın bir kısmını yelkenlerinden ıraksayan üç ana endişe ile alakalıdır.
Birinci sorun Life Sciences (Yaşam Bilimleri) makalesinin veya dergsinin sgRNA (rehber/kılavuz RNA)’nın mitokondriyi hedef aldığı konusunu tam olarak işlememesidir. İkinci olarak, çok düşük düzeyli çift zincir kırık tekrar bağlaması daha önce memeli mitozunda tanımlanmıştır. gRNA ihtiva edilmeden yüksek seviyelerde eksprese edilmiş Cas9 proteini, spesifik olmayan çift iplik indüksiyonu ile sonuçlanır. Üçüncüsü olarak araştırmacıların kullandıkları DSB onarım inhibitörü aslında geleneksel olarak düşünüleni yaptırmayabilir. Başka bir deyiş ile bir zamanlar PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)’in inhibitör olduğu düşünülmesine rağmen daha sonra PARP’in farklı yolakları çalıştırdığı gösterildi. Dahası PARP, mitokondriye bile lokalize değildir.
Son zamanlarda kesinliğe ilginç yeni bir yaklaşım olan, yıkıcı olmayan, hassas ve CRISPR tekniğine gerek görülmeyen mitokondriyal düzenleme tekniğini Harvard ve MIT Board Enstitüsü’den David Liu tarafından keşfedilmiştir. CRISPR’ın gerçek mucidi olarak sık sık anılıyor olsa da siz David Liu’nun kim olduğunu bilmiyor olabilirsiniz çünkü Nobel Komitesindeki modern ve ilerici yüksek yetkililer David Liu’nun CRISPR tasarısını karşılamadığını değerlendirdiler. Liu’nun metodu çift zincir DNA içindeki sitozinlerin deaminasyonunu katalizleyen bakteriyel toksin DddA’ya dayanmaktadır. Liu, bir urasil glikozilaz inhibitörü ve TALEN-benzeri proteinleri insan mtDNA’sına ilave ederek yüksek spesfiteye sahip ve saf ürünler olan, C’den G’ye, T’den A’ya dönüşümlerini katalizleyebilen RNA’sız DddA türevli sitozin baz düzenleyicileri (DdCBE’ler) üretti.
DdCBE’lerin potansiyelini daha ileri keşifleri için Liu ve grup arkadaşları mitokondrideki MT-ND1, MT-ND2, Mt-ND4, MT-ND5 ve MT-ATP8 genlerini başarılı bir şekilde düzenlediler. Mesela sitede yer alan pCMV omurgasında ve memeli hücrelerinde eksprese edilen ND4-DdCBE olarak isimlendirilen ve sağ tarafındaki TALE (Transcription activator-like effector-Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör)’ de ND4 yapıları vardır. Spesifik baz çiftlerinin mitokondriyel düzenlenmesi tamamlandığında mtDNA’nın basitçe bölünmesi çok daha üstün olsa dahi bu yaklaşımda çoğunllukla kalıntılar gözlemlenecektir. Hatalar düzenleme yapan kişinin gerçekleştirebileceği spesifik dönüşümler durumundaysa eğer mutantların, tashihleri mümkün olacaktır.
Bu tür bir teknoloji ile uğraşmak, kalıcı mitokondriyal heteroplazminin yeni ve faydalı biçimlerinin oluşturulup-oluşturulmayacağı sorununu gündeme getiriyor. Örneğin yüksek oksijen seviyesine daha iyi adapte olmuş/uyum sağlayabilmiş ya da termojenezis açısından gelişmiş heteroplazmik mitokondriyi tanımlamak ya da oluşturmak mümkün olabilir. Her halükarda bu manipülasyonların devralınması pek mümkün olmayan bir durum eğer gerçekten mümkün değilse, germ (üreme) hücrelerine giremezler.
Tuatara olarak bilinen ve ender bir omurgalı olup yakın zamanlarda %10 sekans farklılığına rağmen iki mitokondri kökenin devam ettirdiği bulundu. Çift kabuklu yumuşakçaların evrimsel olarak korunmuş mitokondrileri biparental olarak geçer yani hem anneden hem de babadan kalıtılarak hayvanlar aleminde oldukça duyulmamış bir şeydir. Araştırmacılar, biparental (hem anneden hem de babadan) olarak kalıtılan mtDNA’nın ve iki farklı mitokondriyal genoma sahip olmanın, beklenmedik bir şekilde soğuğa karşı dirençli bir sürüngen için bir çeşit avantaj sağlayacağını düşünüyorlar.
İnsanlarda çeşitli nörolojik ve nadir hastalıklar için mitokondriyal düzenlemeye bol miktarda ihtiyaç vardır. Örneğin otizmde G8363A transfer RNA(Lys) mutasyonu ile ilgili bir ilişki kurulmuştur. Son zamanlarda yapılan diğer çalışmalarda kesin bir şekilde otistik endofenotiplere sahip farelerin N6 geninin yanlış anlamlı mutasyonu sonucu mitokondriyal bir eksiklik olduğunu göstermiştir. N6, NADH dehidrogenazın bir alt sınıfı olup solunum kompleksi I olarak formlarında da bulunur. Otizmde nükleer GWAS çalışmalarında hastalığa sebep olan genleri belirlemeye çalışırken herkesin bildiği üzere endişe verici tutarsızlıklar ile bağlantısı olsa da, hayvan modellerinde uygulanan mitokondriyal düzenleme, bu hastalığın altında yatan önemli bir mitokondriyal bileşenin hastalığın tanımlanmasında ve sonuç olarak da daha iyi tedavi stratejileri için de doğrudan bir alternatif olabilir.
Kaynak: https://phys.org/news/2021-02-crispr-mitochondria-biotech.html
Görsel Kaynak: https://www.genengnews.com/insights/for-confidence-in-crispr-outcomes-results-must-be-fully-validated/
Editör: Meryem GÖKOĞLU